Ce stă la baza hibridizării ADN-ului? Deși secvența de ADN dublu catenar este în general stabilă în condiții fiziologice, modificarea acestor condiții în laborator (de obicei prin creșterea temperaturii ambientale) va determina separarea moleculelor în catene individuale. Acestea din urmă sunt complementare între ele, dar pot completa și alte secvențe prezente în mediul lor. Scăderea temperaturii ambiante permite moleculelor monocatenar să se recoace sau să se „hibridizeze” unele cu altele. Aceasta este metoda de hibridizare a ADN-ului.
Conceptul din punctul de vedere al biologiei moleculare
Oamenii de știință implicați atât în replicarea ADN-ului, cât și în transcrierea ADN-ului în ARN se bazează pe încrucișări de nucleotide și pe tehnici de biologie moleculară. Acestea includ petele Southern și Northern, reacția în lanț a polimerazei (PCR) și majoritatea abordărilor de hibridizare și secvențiere ADN-ARN.
Aplicație
Hibridizarea este principala proprietate a nucleotidelorsecvențe și este utilizat în numeroase metode de biologie moleculară. Relația genetică generală a două specii poate fi determinată prin hibridizarea segmentelor ADN-ului lor (hibridarea ADN-ADN). Datorită asemănărilor de secvență dintre organisme strâns înrudite, este necesară o temperatură mai ridicată pentru a topi astfel de hibrizi de ADN în comparație cu organisme mai îndepărtate. Diverse metode folosesc hibridizarea pentru a determina originea unei probe de ADN, inclusiv reacția în lanț a polimerazei (PCR). Într-o altă metodă, secvențele scurte de ADN sunt hibridizate cu ARNm celular pentru a identifica genele exprimate. Companiile farmaceutice explorează utilizarea ARN-ului antisens pentru a se lega de ARNm nedorit, împiedicând ribozomul să traducă ARNm în proteine.
Hbridizarea ADN-ADN se referă în general la o tehnică de biologie moleculară care măsoară gradul de similitudine genetică între grupurile de secvențe ADN. Este folosit în mod obișnuit pentru a determina distanța genetică dintre două organisme. A fost utilizat pe scară largă în filogenie și taxonomie.
Metodologie
ADN de la un organism a fost etichetat, apoi amestecat cu ADN nemarcat care ar putea fi comparat cu acesta. Amestecul este incubat pentru a permite catenelor de ADN să se disocieze și apoi să se răcească pentru a forma un ADN dublu catenar hibrid regenerat. Secvențele hibridizate cu un grad ridicat de similitudine se vor lega mai strâns și vor necesita mai multă energie pentru a le separa: adică, se separă atunci când sunt încălzite la o temperatură mai mare.temperatură decât secvențe diferite, un proces cunoscut sub numele de „topirea ADN-ului”.
Topirea ADN
Evaluând profilul de topire al ADN-ului hibridizat, ADN-ul dublu catenar este legat de o așa-numită „coloană” și amestecul rezultat este încălzit. La fiecare pas, coloana este spălată și secvențele de ADN care se topesc devin monocatenar și se spală de coloană. Temperaturile la care ADN-ul marcat iese din coloană reflectă gradul de similitudine dintre secvențe (și modelul de autopliere servește drept control). Aceste rezultate sunt combinate pentru a determina gradul de similitudine genetică între organisme. Conform microbiologiei moderne, hibridizarea ADN-ului este imposibilă fără a înțelege aceste lucruri.
Când mai multe specii de acid ribonucleic (sau dezoxiribonucleic) sunt comparate în acest fel, valorile de similaritate permit ca speciile să fie plasate în arborele filogenetic. Prin urmare, aceasta este una dintre posibilele abordări de a efectua sistematica moleculară. Charles Sibley și John Ahlquist, pionierii acestei tehnici, au folosit hibridizarea ADN-ADN pentru a studia relațiile filogenetice dintre păsări (taxonomia Sibley-Ahlquist) și primate.
Importanța pentru biologie
Hbridizarea ADN-ADN este standardul de aur pentru distingerea speciilor bacteriene, cu o valoare de similaritate de peste 70%, ceea ce indică faptul că tulpinile comparate aparțin unor specii diferite. În 2014, a fost propus un prag de 79% similaritate pentru separarea unei subspecii bacteriene.
Criticii susțin că tehnica este inexactă pentru compararea speciilor strâns înrudite, deoarece orice încercare de a măsura diferențele dintre secvențele ortologe dintre organisme este copleșită de hibridizarea omologilor paralogi în genomul unui organism. Secvențierea ADN-ului și comparațiile de secvențe computaționale sunt în prezent metoda folosită în mod obișnuit pentru determinarea distanței genetice, deși această abordare este încă folosită în microbiologie pentru a ajuta la identificarea bacteriilor.
Modul actual este de a realiza hibridizarea ADN-ADN în silicon folosind genomi secvențializați complet sau parțial. GGDC dezvoltat de DSMZ este cel mai precis instrument cunoscut pentru calcularea valorilor asemănătoare DDH. Printre alte îmbunătățiri algoritmice, rezolvă problema cu secvențele paraloge, filtrăndu-le cu atenție din potrivirile dintre două secvențe de genom.
Metoda FISH
Hibridarea prin fluorescență in situ (FISH) este o tehnică de laborator folosită pentru detectarea și secvenția ADN-ului, adesea pe un anumit cromozom.
În 1969, Joseph Gall și Mary Lou Pardu au publicat o lucrare care demonstrează că copiile radioactive ale unei secvențe de ADN ribozomal ar putea fi folosite pentru a detecta secvențe ADN complementare în nucleul unui ou de broaște. De la aceste observații originale, multe rafinamente au sporit versatilitatea șisensibilitatea procedurii într-o asemenea măsură încât hibridizarea in situ („în loc”, latină) este acum considerată un instrument important în citogenetică. (Termenul in situ este folosit acum pentru a se referi la stadiul inițial de creștere a carcinomului, când doar țesutul epitelial este implicat în procesul patologic.)
Secvență de hibridizare fluorescentă
Sondele
ARN pot fi proiectate pentru orice genă sau orice secvență dintr-o genă pentru a vizualiza ARNm lncRNA și miARN în țesuturi și celule. FISH este utilizat prin studierea ciclului de reproducere celulară, în special a interfazei nucleare pentru orice anomalii cromozomiale. FISH vă permite să analizați o serie mare de cazuri de arhivă, este mult mai ușor să identificați cromozomul identificat prin crearea unei sonde cu o bază de cromozom artificială care va atrage cromozomi similari.
Semnale de hibridizare pentru fiecare sondă atunci când este detectată o anomalie nucleară: fiecare sondă de detecție ARNm și lncRNA constă din 20 de perechi de oligonucleotide, fiecare pereche acoperă un spațiu de 40-50 bp. p. Sondele folosesc chimie proprie pentru a detecta ARNm.
Hibridare cu sonde ADN
Sondele sunt adesea realizate din fragmente de ADN care au fost izolate, purificate și amplificate pentru a fi utilizate în proiectarea genomului uman. Dimensiunea genomului uman este atât de mare în comparație cu lungimea care poate fi secvențiată direct încât este necesar să-l împărțim înfragmente. În cele din urmă, aceste fragmente au fost ordonate prin digerarea unei copii a fiecărui fragment în unități și mai mici folosind endonucleaze specifice secvenței pentru a măsura dimensiunea fiecărui fragment mic folosind cromatografia de excludere a mărimii folosind aceste informații pentru a determina unde fragmentele mari s-au suprapus unele cu altele..
Pentru a păstra elementele cu secvențele lor individuale de ADN, fragmentele au fost adăugate la un sistem de populații bacteriene care se repetă mereu. Populațiile clonale de bacterii, fiecare populație menținând un singur cromozom artificial, sunt stocate în diferite laboratoare din întreaga lume. Cromozomii artificiali (BAC) pot fi cultivați, extrași și etichetați în orice laborator care conține o bibliotecă. Bibliotecile genomice sunt adesea numite după instituțiile în care au fost dezvoltate. Un exemplu este biblioteca RPCI-11, numită după Roswell Cancer Institute din Buffalo (New York, SUA). Aceste fragmente alcătuiesc aproximativ 100 de mii de perechi de baze și sunt baza majorității sondelor FISH.
