Proteina este o componentă esențială a tuturor organismelor. Fiecare dintre moleculele sale constă dintr-unul sau mai multe lanțuri polipeptidice constând din aminoacizi. Deși informațiile necesare vieții sunt codificate în ADN sau ARN, proteinele recombinante îndeplinesc o gamă largă de funcții biologice în organisme, inclusiv cataliză enzimatică, protecție, sprijin, mișcare și reglare. În funcție de funcțiile lor în organism, aceste substanțe pot fi împărțite în diferite categorii, precum anticorpi, enzime, componentă structurală. Având în vedere funcțiile lor importante, astfel de compuși au fost studiați intens și utilizați pe scară largă.
În trecut, principala modalitate de a obține o proteină recombinată era izolarea acesteia dintr-o sursă naturală, care este de obicei ineficientă și consumatoare de timp. Progresele recente în tehnologia moleculară biologică au făcut posibilă clonarea ADN-ului care codifică un set specific de substanțe într-un vector de expresie pentru substanțe precum bacterii, drojdii, celule de insecte și celule de mamifere.
Pur simplu spus, proteinele recombinante sunt traduse prin produse ADN exogene încelule vii. Obținerea acestora implică de obicei doi pași principali:
- Clonarea unei molecule.
- Expresia proteinelor.
În prezent, producerea unei astfel de structuri este una dintre cele mai puternice metode folosite în medicină și biologie. Compoziția are o largă aplicație în cercetare și biotehnologie.
Directia medicala
Proteinele recombinante oferă tratamente importante pentru diferite boli precum diabet, cancer, boli infecțioase, hemofilie și anemie. Formulările tipice ale unor astfel de substanțe includ anticorpi, hormoni, interleukine, enzime și anticoagulante. Există o nevoie tot mai mare de formulări recombinante pentru uz terapeutic. Acestea vă permit să extindeți metodele de tratament.
proteinele recombinate modificate genetic joacă un rol cheie pe piața medicamentelor terapeutice. Celulele de mamifere produc în prezent cei mai mulți agenți terapeutici, deoarece formulările lor sunt capabile să producă substanțe naturale de în altă calitate. În plus, multe proteine terapeutice recombinante aprobate sunt produse în E. coli datorită geneticii bune, creșterii rapide și productivității ridicate. De asemenea, are un efect pozitiv asupra dezvoltării medicamentelor pe bază de această substanță.
Cercetare
Obținerea proteinelor recombinante se bazează pe diferite metode. Substanțele ajută la aflarea principiilor de bază și fundamentale ale organismului. Aceste molecule pot fi folosite pentru a identifica și determinalocația substanței codificată de o anumită genă și pentru a dezvălui funcția altor gene în diferite activități celulare, cum ar fi semnalizarea celulelor, metabolismul, creșterea, replicarea și moartea, transcripția, traducerea și modificarea compușilor discutați în articol.
Astfel, compoziția observată este adesea folosită în biologia moleculară, biologia celulară, biochimie, studii structurale și biofizice și multe alte domenii ale științei. În același timp, obținerea de proteine recombinate este o practică internațională.
Astfel de compuși sunt instrumente utile în înțelegerea interacțiunilor intercelulare. S-au dovedit eficienți în mai multe metode de laborator, cum ar fi ELISA și imunohistochimia (IHC). Proteinele recombinante pot fi utilizate pentru a dezvolta teste enzimatice. Când sunt utilizate în combinație cu o pereche de anticorpi corespunzători, celulele pot fi folosite ca standarde pentru noile tehnologii.
Biotehnologie
Proteinele recombinante care conțin o secvență de aminoacizi sunt, de asemenea, folosite în industrie, producția alimentară, agricultură și bioinginerie. De exemplu, în creșterea animalelor, enzimele pot fi adăugate în alimente pentru a crește valoarea nutritivă a ingredientelor pentru furaje, pentru a reduce costurile și risipa, pentru a sprijini sănătatea intestinului animal, pentru a îmbunătăți productivitatea și pentru a îmbunătăți mediul.
În plus, bacteriile de acid lactic (LAB) pentru o lungă perioadă de timpau fost folosite pentru a produce alimente fermentate, iar recent LAB a fost dezvoltat pentru exprimarea proteinelor recombinante care conțin o secvență de aminoacizi, care poate fi utilizată pe scară largă, de exemplu, pentru a îmbunătăți digestia umană, animală și nutrițională.
Totuși, aceste substanțe au și limitări:
- În unele cazuri, producția de proteine recombinate este complexă, costisitoare și consumatoare de timp.
- Substanțele produse în celule pot să nu se potrivească cu formele naturale. Această diferență poate reduce eficacitatea proteinelor recombinante terapeutice și chiar poate provoca efecte secundare. În plus, această diferență poate afecta rezultatele experimentelor.
- Principala problemă cu toate medicamentele recombinante este imunogenitatea. Toate produsele biotehnologice pot prezenta o anumită formă de imunogenitate. Este dificil de prezis siguranța noilor proteine terapeutice.
În general, progresele în biotehnologie au crescut și au facilitat producția de proteine recombinante pentru o varietate de aplicații. Deși au încă unele dezavantaje, substanțele sunt importante în medicină, cercetare și biotehnologie.
Link de boală
proteina recombinantă nu este dăunătoare pentru oameni. Este doar o parte integrantă a moleculei generale în dezvoltarea unui anumit medicament sau element nutrițional. Multe studii medicale au arătat că exprimarea forțată a proteinei FGFBP3 (abreviat BP3) într-o tulpină de laborator de șoareci obezi a arătat o reducere semnificativă a grăsimii lor corporale.în masă, în ciuda predispoziției genetice de utilizare.
Rezultatele acestor studii arată că proteina FGFBP3 poate oferi o nouă terapie pentru tulburările asociate cu sindromul metabolic, cum ar fi diabetul de tip 2 și boala ficatului gras. Dar, deoarece BP3 este o proteină naturală și nu un medicament artificial, studiile clinice ale BP3 uman recombinant ar putea începe după runda finală de studii preclinice. Pe, adică există motive legate de siguranța efectuării unor astfel de studii. Proteina recombinată nu este dăunătoare pentru oameni datorită procesării și purificării sale trepte. Au loc schimbări și la nivel molecular.
PD-L2, unul dintre jucătorii cheie în imunoterapie, a fost nominalizat la Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină 2018. Această muncă, începută de Prof. James P. Allison din SUA și Prof. Tasuku Honjo din Japonia, a condus la tratamentul unor cancere precum melanomul, cancerul pulmonar și altele pe baza imunoterapiei punct de control. Recent, AMSBIO a adăugat un nou produs major liniei sale de imunoterapie, activatorul PD-L2/TCR - CHO Recombinant Cell Line.
În experimente de demonstrare a conceptului, cercetătorii de la Universitatea din Alabama din Birmingham, conduși de H. Long Zheng, MD, profesorul Robert B. Adams și directorul de medicină de laborator, departamentul de patologie, Școala UAB de Medicină, au evidențiat o potențială terapie o tulburare de sângerare rară, dar fatală, TTP.
Rezultatele acestui lucrustudiile demonstrează pentru prima dată că transfuzia de trombocite încărcate cu rADAMTS13 poate fi o abordare terapeutică nouă și potențial eficientă pentru tromboza arterială asociată cu TTP congenital și mediat imun.
Proteina recombinantă nu este doar un nutrient, ci și un medicament în compoziția medicamentului în curs de dezvoltare. Acestea sunt doar câteva domenii care sunt acum implicate în medicină și legate de studiul tuturor elementelor sale structurale. După cum arată practica internațională, structura unei substanțe face posibilă, la nivel molecular, rezolvarea multor probleme grave ale corpului uman.
Dezvoltarea vaccinurilor
O proteină recombinantă este un set specific de molecule care pot fi modelate. O proprietate similară este utilizată în dezvoltarea vaccinurilor. O nouă strategie de vaccinare, cunoscută și sub numele de utilizarea unei injecții speciale de virus recombinant, ar putea proteja milioane de pui expuși riscului de o boală respiratorie gravă, au spus cercetătorii de la Universitatea din Edinburgh și de la Institutul Pirbright. Aceste vaccinuri folosesc versiuni inofensive sau slabe ale unui virus sau bacterii pentru a introduce germeni în celulele corpului. În acest caz, experții au folosit ca vaccinuri viruși recombinanți cu diferite proteine spike pentru a crea două versiuni ale unui virus inofensiv. Există multe medicamente diferite construite în jurul acestei conexiuni.
Numele comerciale de proteine recombinate și analogii sunt după cum urmează:
- „Fortelizin”.
- „Z altrap”.
- „Eylea”.
Acestea sunt în principal medicamente anticanceroase, dar există și alte domenii de tratament asociate cu această substanță activă.
Un nou vaccin, numit și LASSARAB, conceput pentru a proteja oamenii atât împotriva febrei Lassa, cât și împotriva rabiei, a arătat rezultate promițătoare în studiile preclinice, potrivit unui nou studiu publicat în revista științifică Nature Communications. Un candidat vaccin recombinant inactivat folosește un virus rabic slăbit.
Echipa de cercetare a introdus material genetic al virusului Lassa într-un vector al virusului rabiei, astfel încât vaccinul să exprime proteine de suprafață atât în celulele Lassa, cât și în celulele rabiei. Acești compuși de suprafață provoacă un răspuns imun împotriva agenților infecțioși. Acest vaccin a fost apoi inactivat pentru a „distruge” virusul rabiei viu folosit pentru a face purtător.
Obținerea metodelor
Există mai multe sisteme pentru producerea unei substanțe. Metoda generală de obținere a unei proteine recombinante se bazează pe obținerea de material biologic din sinteza. Dar există și alte moduri.
În prezent, există cinci sisteme principale de expresie:
- Sistem de exprimare E. coli.
- Sistem de exprimare a drojdiei.
- Sistem de exprimare a celulelor de insecte.
- Sistem de exprimare a celulelor de mamifere.
- Sistem de exprimare a proteinelor fără celule.
Aceasta din urmă opțiune este potrivită în special pentru exprimarea proteinelor transmembranareși compuși toxici. În ultimii ani, substanțele care sunt greu de exprimat prin metode intracelulare convenționale au fost integrate cu succes în celule in vitro. În Belarus, producția de proteine recombinante este utilizată pe scară largă. Există o serie de întreprinderi de stat care se ocupă de această problemă.
Cell Free Protein Synthesis System este o metodă rapidă și eficientă de sinteză a substanțelor țintă prin adăugarea diferitelor substraturi și compuși energetici necesari pentru transcripție și traducere în sistemul enzimatic al extractelor celulare. În ultimii ani, au apărut treptat avantajele metodelor fără celule pentru tipuri de substanțe precum membranele complexe, toxice, demonstrând potențiala aplicare a acestora în domeniul biofarmaceutic.
Tehnologia fără celule poate adăuga o varietate de aminoacizi nenaturali cu ușurință și într-o manieră controlată pentru a realiza procese complexe de modificare care sunt dificil de rezolvat după expresia recombinantă convențională. Astfel de metode au valoare mare de aplicare și potențial pentru livrarea de medicamente și dezvoltarea de vaccinuri folosind particule asemănătoare virusului. Un număr mare de proteine membranare au fost exprimate cu succes în celulele libere.
Exprimarea compozițiilor
Proteina recombinantă CFP10-ESAT 6 este produsă și utilizată pentru a crea vaccinuri. Un astfel de alergen de tuberculoză vă permite să întăriți sistemul imunitar și să dezvoltați anticorpi. În general, studiile moleculare implică studiul oricărui aspect al unei proteine, cum ar fi structura, funcția, modificările, localizarea sau interacțiunile. A exploramodul în care anumite substanțe reglează procesele interne, cercetătorii au nevoie de obicei de mijloace pentru a produce compuși funcționali de interes și beneficii.
Având în vedere dimensiunea și complexitatea proteinelor, sinteza chimică nu este o opțiune viabilă pentru acest demers. În schimb, celulele vii și mașinile lor celulare sunt de obicei folosite ca fabrici pentru a crea și a construi substanțe pe baza șabloanelor genetice furnizate. Sistemul de exprimare a proteinei recombinate generează apoi structura necesară pentru a crea un medicament. Urmează selecția materialului necesar pentru diferite categorii de medicamente.
Spre deosebire de proteine, ADN-ul este ușor de construit sintetic sau in vitro, folosind tehnici de recombinare bine stabilite. Prin urmare, şabloane de ADN ale genelor specifice, cu sau fără secvenţe reporter adăugate sau secvenţe de tag de afinitate, pot fi proiectate ca şabloane pentru exprimarea substanţei monitorizate. Astfel de compuși derivați din astfel de șabloane ADN sunt numiți proteine recombinate.
Strategiile tradiționale pentru exprimarea unei substanțe implică transfectarea celulelor cu un vector ADN care conține un șablon și apoi cultivarea celulelor pentru a transcrie și a traduce proteina dorită. De obicei, celulele sunt apoi lizate pentru a extrage compusul exprimat pentru purificarea ulterioară. Proteina recombinantă CFP10-ESAT6 este procesată în acest mod și trece printr-un sistem de purificare din posibileformarea de toxine. Abia după aceea va fi sintetizat într-un vaccin.
Atât sistemele de expresie in vivo procariote, cât și eucariote pentru substanțe moleculare sunt utilizate pe scară largă. Alegerea sistemului depinde de tipul de proteină, de cerința de activitate funcțională și de randamentul dorit. Aceste sisteme de expresie includ mamifere, insecte, drojdii, bacterii, alge și celule. Fiecare sistem are propriile avantaje și provocări, iar alegerea sistemului potrivit pentru o anumită aplicație este importantă pentru exprimarea cu succes a substanței analizate.
Expresie de la mamifere
Utilizarea proteinelor recombinante permite dezvoltarea de vaccinuri și medicamente de diferite niveluri. Pentru aceasta se poate folosi această metodă de obținere a unei substanțe. Sistemele de expresie ale mamiferelor pot fi utilizate pentru a produce proteine din regnul animal care au cea mai nativă structură și activitate datorită mediului lor relevant din punct de vedere fiziologic. Acest lucru are ca rezultat niveluri ridicate de procesare post-traducere și activitate funcțională. Sistemele de expresie la mamifere pot fi utilizate pentru a produce anticorpi, proteine complexe și compuși pentru utilizare în teste funcționale pe bază de celule. Cu toate acestea, aceste beneficii sunt cuplate cu condiții de cultură mai stricte.
Sistemele de expresie ale mamiferelor pot fi utilizate pentru a genera proteine în mod tranzitoriu sau prin linii celulare stabile în care constructul de expresie este integrat în genomul gazdei. În timp ce astfel de sisteme pot fi utilizate în mai multe experimente, timpulproducția poate genera o cantitate mare de substanță în una sau două săptămâni. Acest tip de biotehnologie a proteinelor recombinante este la mare căutare.
Aceste sisteme de expresie tranzitorii, cu randament ridicat pentru mamifere, folosesc culturi în suspensie și pot produce grame pe litru. În plus, aceste proteine au mai multe modificări native de pliere și post-traducție, cum ar fi glicozilarea, comparativ cu alte sisteme de expresie.
Expresie insectă
Metodele de producere a proteinei recombinate nu se limitează la mamifere. Există și modalități mai productive în ceea ce privește costurile de producție, deși randamentul substanței la 1 litru de lichid tratat este mult mai mic.
Celulele de insecte pot fi folosite pentru a exprima o proteină de nivel în alt cu modificări similare sistemelor de mamifere. Există mai multe sisteme care pot fi folosite pentru a genera baculovirus recombinant, care poate fi apoi folosit pentru a extrage substanța de interes din celulele de insecte.
Expresiile proteinelor recombinante pot fi ușor extinse și adaptate la cultura suspensiei de în altă densitate pentru combinarea pe scară largă a moleculelor. Ele sunt mai asemănătoare din punct de vedere funcțional cu compoziția nativă a materiei mamifere. Deși randamentul poate fi de până la 500 mg/L, producția de baculovirus recombinant poate fi consumatoare de timp și condițiile de cultură sunt mai dificile decât sistemele procariote. Cu toate acestea, în țările mai sudice și mai calde, un lucru similarmetoda este considerată mai eficientă.
Expresie bacteriană
Producerea de proteine recombinante poate fi stabilită cu ajutorul bacteriilor. Această tehnologie este mult diferită de cele descrise mai sus. Sistemele de exprimare a proteinelor bacteriene sunt populare deoarece bacteriile sunt ușor de cultivat, cresc rapid și oferă randamente ridicate ale formulării recombinate. Cu toate acestea, substanțele eucariote cu mai multe domenii exprimate în bacterii sunt adesea nefuncționale, deoarece celulele nu sunt echipate pentru a efectua modificările post-translaționale sau plierea moleculară necesare.
În plus, multe proteine devin insolubile ca molecule de incluziune, care sunt foarte greu de recuperat fără denaturatori duri și procedurile ulterioare greoaie de repliere moleculară. Această metodă este în mare parte considerată a fi încă în mare parte experimentală.
Expresie fără celule
Proteina recombinantă care conține secvența de aminoacizi a stafilokinazei este obținută într-un mod ușor diferit. Este inclus în multe tipuri de injecții, necesitând mai multe sisteme înainte de utilizare.
Expresia proteinelor fără celule este o sinteză in vitro a unei substanțe folosind extracte de celule întregi compatibile translațional. În principiu, extractele de celule întregi conțin toate macromoleculele și componentele necesare pentru transcriere, traducere și chiar modificări post-traduce.
Aceste componente includ ARN polimeraza, factori proteici reglatori, forme de transcripție, ribozomi și ARNt. Când adăugațicofactori, nucleotide și un model specific de genă, aceste extracte pot sintetiza proteine de interes în câteva ore.
Deși nu sunt durabile pentru producția la scară largă, sistemele de exprimare a proteinelor fără celule sau in vitro (IVT) oferă o serie de avantaje față de sistemele convenționale in vivo.
Expresia fără celule permite sinteza rapidă a formulărilor recombinante fără a implica cultura celulară. Sistemele fără celule fac posibilă marcarea proteinelor cu aminoacizi modificați, precum și exprimarea compușilor care suferă o degradare proteolitică rapidă de către proteazele intracelulare. În plus, este mai ușor să exprimați multe proteine diferite în același timp folosind o metodă fără celule (de exemplu, testarea mutațiilor proteinelor prin exprimarea la scară mică din multe șabloane ADN recombinant diferite). În acest experiment reprezentativ, sistemul IVT a fost folosit pentru a exprima proteina caspaza-3 umană.
Concluzii și perspective de viitor
Producerea de proteine recombinate poate fi acum văzută ca o disciplină matură. Acesta este rezultatul a numeroase îmbunătățiri incrementale în purificare și analiză. În prezent, programele de descoperire a medicamentelor sunt rareori oprite din cauza incapacității de a produce proteina țintă. Procesele paralele pentru exprimarea, purificarea și analiza mai multor substanțe recombinante sunt acum bine cunoscute în multe laboratoare din întreaga lume.
Complecși de proteine și succes în creștere în fabricareStructurile membranelor solubilizate vor necesita mai multe modificări pentru a ține pasul cu cererea. Apariția unor organizații eficiente de cercetare prin contract pentru o aprovizionare mai regulată de proteine va permite realocarea resurselor științifice pentru a face față acestor noi provocări.
În plus, fluxurile de lucru paralele ar trebui să permită crearea de biblioteci complete ale substanței monitorizate pentru a permite identificarea de noi ținte și screeningul avansat, împreună cu proiecte tradiționale de descoperire a medicamentelor cu molecule mici.
