Metodele de cercetare biologică moleculară joacă un rol important în medicina modernă, criminalistica și biologie. Datorită progreselor în studiul ADN-ului și ARN-ului, o persoană este capabilă să studieze genomul unui organism, să determine agentul cauzal al unei boli, să recunoască acidul nucleic dorit într-un amestec de acizi etc.
Metode de cercetare biologică moleculară. Ce este?
În anii 70 și 80, oamenii de știință au reușit pentru prima dată să descifreze genomul uman. Acest eveniment a dat impuls dezvoltării ingineriei genetice și a biologiei moleculare. Studiul proprietăților ADN-ului și ARN-ului a condus la faptul că acum este posibil să se utilizeze acești acizi nucleici pentru a diagnostica o boală, studiază genele.
Obținerea ADN și ARN
Metodele de diagnostic biologic molecular necesită prezența materiei prime: mai des este vorba de acizi nucleici. Există mai multe modalități de a izola aceste substanțe din celulele organismelor vii. Fiecare dintre ele are propriile avantaje și dezavantaje și este necesarluați în considerare atunci când alegeți o metodă pentru izolarea acizilor nucleici puri.
1. Obținerea ADN-ului conform lui Marmur. Metoda constă în tratarea unui amestec de substanțe cu alcool, în urma căruia precipită ADN pur. Dezavantajul acestei metode este utilizarea unor substanțe agresive: fenol și cloroform.
2. Izolarea ADN-ului conform lui Boom. Principala substanță folosită aici este tiocianatul de guanidină (GuSCN). Contribuie la precipitarea acidului dezoxiribonucleic pe substraturi specializate, din care ulterior poate fi colectat folosind un tampon special. Cu toate acestea, GuSCN este un inhibitor al PTC și chiar și o mică parte din acesta care intră în ADN-ul precipitat poate afecta cursul reacției în lanț a polimerazei, care joacă un rol important în lucrul cu acizii nucleici.
3. Sedimentarea impurităților. Metoda diferă de cele anterioare prin faptul că nu sunt precipitate moleculele de acid dezoxiribonucleic, ci impuritățile. Pentru a face acest lucru, se folosesc schimbătoare de ioni. Dezavantajul este că nu toate substanțele pot precipita.
4. Screening în masă. Această metodă este utilizată în cazurile în care nu sunt necesare informații exacte despre compoziția moleculei de ADN, dar este necesară obținerea unor date statistice. Acest lucru se explică prin faptul că structura acidului nucleic poate fi deteriorată atunci când este tratat cu detergenți, în special cu alcalii.
Clasificarea metodelor de cercetare
Toate metodele de cercetare biologică moleculară sunt împărțite în trei grupuri mari:
1. Amplificare (folosind multe enzime). Aicise referă la PCR - reacția în lanț a polimerazei, care joacă un rol important în multe dintre metodele de diagnosticare.
2. Neamplificator. Acest grup de metode este direct legat de funcționarea amestecurilor de acizi nucleici. Exemplele sunt 3 pete, hibridizarea in situ etc.
3. Metode bazate pe recunoașterea unui semnal de la o moleculă sondă care se leagă de ADN-ul sau ARN-ul unei probe specifice. Un exemplu este Sistemul de captură hibrid (hc2).
Enzime care pot fi utilizate în metodele de cercetare în biologie moleculară
Multe metode de diagnostic molecular implică utilizarea unei game largi de enzime. Mai jos sunt cele mai frecvent utilizate:
1. Enzima de restricție - „taie” molecula de ADN în părțile necesare.
2. ADN polimeraza - sintetizează o moleculă dublu catenară de acid dezoxiribonucleic.
3. Reverse transcriptază (revertază) - folosită pentru a sintetiza ADN pe un șablon de ARN.
4. ADN ligaza - responsabilă pentru formarea legăturilor fosfodiester între nucleotide.
5. Exonucleaza - elimină nucleotidele din secțiunile terminale ale moleculei de acid dezoxiribonucleic.
PCR este metoda principală de amplificare a ADN
Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este utilizată activ în biologia moleculară modernă. Aceasta este o metodă prin care se poate obține un număr mare de copii dintr-o singură moleculă de ADN (moleculele sunt amplificate).
Funcțiile principale ale PCR:
- diagnosticareboli;
- clonarea segmentelor ADN, a genelor.
Următoarele elemente sunt necesare pentru a realiza o reacție în lanț a polimerazei: molecula inițială de ADN, o ADN polimerază termostabilă (Taq sau Pfu), fosfați dezoxiribonucleotid (surse de baze azotate), primeri (2 primeri per 1 moleculă de ADN).) și sistemul tampon în sine, în care toate reacțiile sunt posibile.
PCR constă în trei etape: denaturare, recoacere primerului și alungire.
1. Denaturarea. La o temperatură de 94-95 grade Celsius, legăturile de hidrogen dintre cele două catene de ADN sunt rupte și, ca urmare, obținem două molecule monocatenar.
2. Recoacere amorsa. La o temperatură de 50-60 de grade Celsius, primerii sunt atașați la capetele moleculelor de acid nucleic monocatenar prin tipul de complementaritate.
3. Elongaţie. La o temperatură de 72 de grade, are loc sinteza moleculelor dublu catenare fiice de acid dezoxiribonucleic.
secvențierea ADN
Metodele de cercetare biologică moleculară necesită adesea cunoașterea secvenței de nucleotide dintr-o moleculă de acid dezoxiribonucleic. Secvențierea este efectuată pentru a determina codul genetic. Diagnosticarea moleculară a viitorului se va baza pe cunoștințele dobândite din secvențierea umană.
Se disting următoarele tipuri de secvențiere:
- Secvențiere Maxam-Gilbert;
- Secvențierea Sanger;
- pyrosequencing;
- nanoporesecvențiere.
