Colorația Gram este utilizată pe scară largă în microbiologie, deoarece este una dintre cele mai ușoare modalități de diferențiere a bacteriilor în funcție de compoziția peretelui celular. Conform Gram, toate bacteriile pot fi împărțite în gram-pozitive (Gram (+)) și gram-negative (Gram (-)). Metoda colorației Gram a fost dezvoltată în 1884 și nu și-a pierdut popularitatea de atunci, deși a fost modificată de mai multe ori.
Structura peretelui celular
Colorația Gram dezvăluie dacă o bacterie este Gram-pozitivă sau Gram-negativă. Împărțirea bacteriilor în Gram (+) și Gram (-) se realizează în conformitate cu structura peretelui celular al acestora.
Peretele celular conține cea mai mare cantitate de peptidoglican (mureină) - o substanță complexă, care include peptapeptidă și glican. Glicanul constă din reziduuri alternative de N-acetilglucozamină și acid N-acetilmuramic legate între ele prin β-1,legături 4-glicozidice. Peptidoglicanul asigură menținerea formei celulelor, protecție osmotică și funcții antigenice.
Principalele diferențe între bacteriile Gram-pozitive și Gram-negative
Diferitele bacterii au grosimi diferite ale stratului de peptidoglican. La bacteriile care sunt clasificate ca gram-pozitive, aceasta variază de la 15 la 80 nm, în timp ce la gram-negative este de la 2 la 8 nm. În același timp, bacteriile Gram-negative au o structură specială sub stratul de peptidoglican, pe care bacteriile Gram-pozitive nu o au - spațiul periplasmatic. Acest spațiu este umplut cu enzime hidrolitice - β-lactamaza, ribonucleaza 1, fosfatază. Aceste enzime sunt responsabile pentru rezistența bacteriilor Gram-negative la multe antibiotice.
Stratul de peptidoglican Gram(-) al bacteriilor este legat de lipopolizaharidă, o structură antigenică care conține endotoxină. În bacteriile Gram(+), acizii teicoici îndeplinesc funcții similare.
Bacteriile gram-negative au o structură suplimentară - membrana exterioară.
Esența metodei de colorare
Înainte de a începe colorarea, se prepară frotiuri ale bacteriilor studiate. Pentru a face acest lucru, apa este picurată pe o lamă de sticlă și se adaugă acolo o cultură de microorganisme cu o buclă bacteriană. Apoi, după ce apa s-a uscat complet, frotiul este fixat - lama de sticlă este purtată de mai multe ori peste flacăra arzătorului. Colorația Gram este mai eficientă decât colorarea bacteriilor vii - moleculele de colorant se leagă mai bine de celulele moarte.
Colorarea se face în mai multe etape:
- Bucăți mici de hârtie de filtru sunt așezate pe un frotiu fix și se toarnă colorantul principal - violet de gențiană sau albastru de metilen.
- După 3-5 minute, îndepărtați hârtia de filtru colorată și umpleți frotiu cu soluție Lugol timp de 1 minut. În acest caz, preparatul se întunecă.
- Soluția de Lugol se scurge și frotiul este tratat cu alcool etilic pur: câteva picături se picura pe preparat, se scurg după 20 de secunde. Procedura se repetă de 2-3 ori.
- Clătiți lama cu preparat de testare cu apă distilată.
- Produceți colorare suplimentară - terminați preparatul cu fuchsin. După 1-2 minute, vopseaua este spălată.
- După ce apa se usucă, examinează frotiul la microscop. Bacteriile Gram pozitive vor fi albastre-violete, bacteriile Gram negative vor fi roz sau roșii.
Cauzele diferitelor modele de colorare
Așa cum este descris mai sus, colorația Gram a bacteriilor colorează bacteriile Gram pozitive în albastru-violet și bacteriile Gram negative în roșu sau roz. Motivul pentru colorarea diferențială a bacteriilor prin această metodă este că, după ce forma solubilă de violet de gențiană intră în celulă, colorantul trece în forma de iod insolubil. În timpul tratării bacteriilor cu alcool etilic, lipidele sunt extrase din membrană sub acțiunea acestui solvent nepolar. Membrana devine apoi poroasă și nu mai reprezintă o barieră semnificativă în calea scurgerii coloranților. in orice cazpeptidoglicanul este mai rezistent la solvenții nepolari, inclusiv la alcool. El este cel care previne spălarea vopselei, astfel încât bacteriile cu un strat gros de murein devin albastru-violet (gram-pozitive), iar după tratamentul cu alcool nu își schimbă culoarea.
Strat subțire de mureină de bacterii gram-negative nu poate reține moleculele de colorant în celulă, așa că, după acțiunea alcoolului, acestea devin incolore - se colorează gram-negativ.
După expunerea unui frotiu la fuchsină, bacteriile colorate Gram rămân albastru-violet, în timp ce bacteriile Gram negative devin roz-roșu.
Exemple de bacterii Gram(+) și Gram(-)
Bacteriile Gram negative includ cianobacteriile, bacteriile sulfuroase, bacteriile de fier, chlamydia, rickettsiae, bacteriile acetice, multe metilobacterii, bacteriile tionice, arsenitobacteriile, carboxibacteriile.
Bifidobacterii, multe bacterii acvatice, streptococi și stafilococi sunt Gram pozitivi.
