Conceptul de enzime imobilizate a apărut pentru prima dată în a doua jumătate a secolului al XX-lea. Între timp, în 1916, s-a descoperit că zaharoza absorbită pe carbon și-a păstrat activitatea catalitică. În 1953, D. Schleit și N. Grubhofer au efectuat prima legare a pepsinei, amilazei, carboxipeptidazei și RNazei cu un purtător insolubil. Conceptul de enzime imobilizate a fost legalizat în 1971. Acest lucru s-a întâmplat la prima conferință de enzimologie de inginerie. În prezent, conceptul de enzime imobilizate este considerat într-un sens mai larg decât era la sfârșitul secolului al XX-lea. Să aruncăm o privire mai atentă asupra acestei categorii.
Informații generale
Enzimele imobilizate sunt compuși care sunt legați artificial de un purtător insolubil. Cu toate acestea, își păstrează proprietățile catalitice. În prezent, acest proces este luat în considerare în două aspecte - în cadrul limitării parțiale și complete a libertății de mișcare a moleculelor de proteine.
Demnitate
Oamenii de știință au stabilit anumite beneficii ale enzimelor imobilizate. Acționând ca catalizatori eterogene, aceștia pot fi ușor separați de mediul de reacție. În cadrul cercetării, s-a constatat că utilizarea enzimelor imobilizate poate fi repetată. În timpul procesului de legare, conexiunile își schimbă proprietățile. Ele dobândesc specificitate și stabilitate de substrat. În același timp, activitatea lor începe să depindă de condițiile de mediu. Enzimele imobilizate sunt durabile și au un grad ridicat de stabilitate. Este mai mare decât, de exemplu, cea a enzimelor libere de mii, zeci de mii de ori. Toate acestea asigură o eficiență ridicată, competitivitate și economie a tehnologiilor în care sunt prezente enzimele imobilizate.
Media
J. Poratu a identificat proprietățile cheie ale materialelor ideale pentru a fi utilizate în imobilizare. Purtătorii trebuie să aibă:
- Insolubilitate.
- Rezistență biologică și chimică ridicată.
- Abilitatea de a activa rapid. Purtătorii ar trebui să devină ușor reactivi.
- Hidrofilitate semnificativă.
- Permeabilitatea necesară. Indicatorul său ar trebui să fie la fel de acceptabil atât pentru enzime, cât și pentru coenzime, produse de reacție și substraturi.
În prezent, nu există niciun material care să îndeplinească pe deplin aceste cerințe. Cu toate acestea, în practică, se folosesc purtători care sunt potriviti pentru imobilizare.anumite categorii de enzime în anumite condiții.
Clasificare
În funcție de natura lor, materialele, în legătură cu care compușii sunt transformați în enzime imobilizate, se împart în anorganice și organice. Legarea multor compuși se realizează cu purtători polimerici. Aceste materiale organice sunt împărțite în 2 clase: sintetice și naturale. În fiecare dintre ele, la rândul lor, se disting grupuri în funcție de structură. Purtătorii anorganici sunt reprezentați în principal de materiale din sticlă, ceramică, argilă, silicagel și negru de grafit. Când lucrați cu materiale, metodele chimice uscate sunt populare. Enzimele imobilizate se obțin prin acoperirea purtătorilor cu o peliculă de oxizi de titan, aluminiu, zirconiu, hafniu sau prin prelucrare cu polimeri organici. Un avantaj important al materialelor este ușurința de regenerare.
Purtători de proteine
Cele mai populare sunt materialele lipidice, polizaharide și proteice. Dintre acestea din urmă, merită evidențiați polimerii structurali. Acestea includ în principal colagen, fibrină, cheratina și gelatină. Astfel de proteine sunt distribuite pe scară largă în mediul natural. Sunt accesibile și economice. În plus, au un număr mare de grupări funcționale pentru legare. Proteinele sunt biodegradabile. Acest lucru permite extinderea utilizării enzimelor imobilizate în medicină. Între timp, proteinele au și proprietăți negative. Dezavantajele utilizării enzimelor imobilizate pe purtătorii de proteine sunt imunogenitatea ridicată a acestora din urmă, precum șicapacitatea de a introduce în reacții doar anumite grupuri dintre ei.
Polizaharide, aminozaharide
Dintre aceste materiale, cel mai des se folosesc chitina, dextranul, celuloza, agaroza și derivații acestora. Pentru a face polizaharidele mai rezistente la reacții, lanțurile lor liniare sunt reticulate cu epiclorhidrina. Diverse grupuri ionogene sunt introduse liber în structurile rețelei. Chitina se acumulează în cantități mari ca deșeuri în timpul prelucrării industriale a creveților și crabilor. Această substanță este rezistentă la substanțe chimice și are o structură poroasă bine definită.
Polimeri sintetici
Acest grup de materiale este foarte divers și accesibil. Include polimeri pe bază de acid acrilic, stiren, alcool polivinilic, poliuretan și polimeri poliamidici. Cele mai multe dintre ele sunt puternice din punct de vedere mecanic. În procesul de transformare, acestea oferă posibilitatea de a varia dimensiunea porilor într-un interval destul de larg, introducând diverse grupe funcționale.
Metode de legare
În prezent, există două opțiuni fundamental diferite pentru imobilizare. Primul este de a obține compuși fără legături covalente cu purtătorul. Această metodă este fizică. O altă opțiune implică apariția unei legături covalente cu materialul. Aceasta este o metodă chimică.
Adsorbție
Cu ajutorul acestuia, se obțin enzime imobilizate prin ținerea medicamentului pe suprafața purtătorului datoritădispersie, interacțiuni hidrofobe, electrostatice și legături de hidrogen. Adsorbția a fost prima modalitate de a limita mobilitatea elementelor. Cu toate acestea, nici acum această opțiune nu și-a pierdut relevanța. În plus, adsorbția este considerată cea mai comună metodă de imobilizare din industrie.
Caracteristicile metodei
Publicațiile științifice descriu peste 70 de enzime obținute prin metoda adsorbției. Purtătorii erau în principal sticlă poroasă, diverse argile, polizaharide, oxizi de aluminiu, polimeri sintetici, titan și alte metale. Acestea din urmă sunt cele mai utilizate. Eficacitatea adsorbției medicamentului pe purtător este determinată de porozitatea materialului și de suprafața specifică.
Mecanism de acțiune
Adsorbția enzimatică pe materiale insolubile este simplă. Se realizează prin contactul unei soluții apoase a medicamentului cu purtătorul. Poate trece într-un mod static sau dinamic. Soluția de enzimă este amestecată cu sediment proaspăt, de exemplu, hidroxid de titan. Compusul este apoi uscat în condiții blânde. Activitatea enzimatică în timpul unei astfel de imobilizări este reținută cu aproape 100%. În același timp, concentrația specifică atinge 64 mg per gram de purtător.
Momente negative
Dezavantajele adsorbției includ rezistența scăzută la legarea enzimei și purtătorului. În procesul de modificare a condițiilor de reacție, se poate observa pierderea elementelor, contaminarea produselor și desorbția proteinelor. Pentru a îmbunătăți putereasuporturile de legare sunt pre-modificate. În special, materialele sunt tratate cu ioni metalici, polimeri, compuși hidrofobi și alți agenți polifuncționali. În unele cazuri, medicamentul în sine este modificat. Dar destul de des acest lucru duce la o scădere a activității sale.
Includerea în gel
Această opțiune este destul de comună datorită unicității și simplității sale. Această metodă este potrivită nu numai pentru elemente individuale, ci și pentru complexe multi-enzime. Încorporarea în gel se poate face în două moduri. În primul caz, medicamentul este combinat cu o soluție apoasă de monomer, după care se efectuează polimerizarea. Ca urmare, apare o structură spațială de gel, care conține molecule de enzime în celule. În al doilea caz, medicamentul este introdus în soluția polimerului finit. Apoi este pus în stare de gel.
Intruziunea în structurile translucide
Esența acestei metode de imobilizare este separarea unei soluții apoase de enzime de substrat. Pentru aceasta, se folosește o membrană semi-permeabilă. Permite trecerea elementelor cu greutate moleculară mică ale cofactorilor și substraturilor și rețin moleculele mari de enzime.
Microîncapsulare
Există mai multe opțiuni pentru încorporarea în structuri translucide. Dintre acestea, microîncapsularea și încorporarea proteinelor în lipozomi sunt de cel mai mare interes. Prima variantă a fost propusă în 1964 de T. Chang. Constă în faptul că soluția de enzimă este introdusă într-o capsulă închisă, ai cărei pereți sunt din semipermeabil.polimer. Apariția unei membrane la suprafață este cauzată de reacția de policondensare interfacială a compușilor. Unul dintre ele este dizolvat în substanța organică, iar celăl alt - în fază apoasă. Un exemplu este formarea unei microcapsule obţinute prin policondensarea halogenurei de acid sebacic (fază organică) şi hexametilendiamină-1, 6 (respectiv, fază apoasă). Grosimea membranei se calculează în sutimi de micrometru. Dimensiunea capsulelor este de sute sau zeci de micrometri.
Încorporarea în lipozomi
Această metodă de imobilizare este aproape de microîncapsulare. Lipozomii sunt prezentați în sisteme lamelare sau sferice de bistraturi lipidice. Această metodă a fost folosită pentru prima dată în 1970. Pentru a izola lipozomii dintr-o soluție de lipide, solventul organic este evaporat. Filmul subțire rămas este dispersat într-o soluție apoasă în care este prezentă enzima. În timpul acestui proces, are loc auto-asamblarea structurilor bistraturi lipidice. Astfel de enzime imobilizate sunt destul de populare în medicină. Acest lucru se datorează faptului că majoritatea moleculelor sunt localizate în matricea lipidică a membranelor biologice. Enzimele imobilizate incluse în lipozomi sunt cel mai important material de cercetare în medicină, ceea ce face posibilă studierea și descrierea tiparelor proceselor vitale.
Formarea de noi obligațiuni
Imobilizarea prin formarea de noi lanțuri covalente între enzime și purtători este considerată cea mai răspândită metodă de obținere a biocatalizatorilor industriali.destinaţie. Spre deosebire de metodele fizice, această opțiune oferă o legătură ireversibilă și puternică între moleculă și material. Formarea sa este adesea însoțită de stabilizarea medicamentului. În același timp, localizarea enzimei la o distanță de prima legătură covalentă față de purtător creează anumite dificultăți în implementarea procesului catalitic. Molecula este separată de material prin intermediul unei inserții. Este adesea folosit ca agenți poli- și bifuncționali. În special, acestea sunt hidrazină, bromură de cianogen, dialhedridă glutaric, clorură de sulfuril etc. De exemplu, pentru a îndepărta galactosiltransferaza, următoarea secvență este inserată între purtător și enzima -CH2- NH-(CH2)5-CO-. Într-o astfel de situație, o inserție, o moleculă și un purtător sunt prezente în structură. Toate sunt conectate prin legături covalente. De o importanță fundamentală este necesitatea introducerii în reacție a grupărilor funcționale care nu sunt esențiale pentru funcția catalitică a elementului. Deci, de regulă, glicoproteinele sunt atașate de purtător nu prin intermediul proteinei, ci prin partea carbohidraților. Ca rezultat, se obțin enzime imobilizate mai stabile și mai active.
celule
Metodele descrise mai sus sunt considerate universale pentru toate tipurile de biocatalizatori. Acestea includ, printre altele, celule, structuri subcelulare, a căror imobilizare a devenit recent răspândită. Acest lucru se datorează următoarelor. Când celulele sunt imobilizate, nu este nevoie să izolați și să purificați preparatele enzimatice sau să introduceți cofactori în reacții. Ca urmare, devine posibilsisteme care efectuează procese continue în mai multe etape.
Utilizarea enzimelor imobilizate
În medicina veterinară, industrie și alte sectoare economice, medicamentele obținute prin metodele de mai sus sunt destul de populare. Abordările dezvoltate în practică oferă o soluție la problemele de livrare țintită a medicamentelor în organism. Enzimele imobilizate au făcut posibilă obținerea de medicamente cu acțiune prelungită cu alergenitate și toxicitate minime. În prezent, oamenii de știință rezolvă problemele asociate cu bioconversia masei și energiei folosind abordări microbiologice. Între timp, tehnologia enzimelor imobilizate aduce, de asemenea, o contribuție semnificativă la lucru. Perspectivele de dezvoltare par a fi destul de largi. Deci, pe viitor, unul dintre rolurile cheie în procesul de monitorizare a stării mediului ar trebui să aparțină noilor tipuri de analiză. În special, vorbim despre metode bioluminiscente și imunotestare enzimatică. Abordările avansate sunt de o importanță deosebită în prelucrarea materiilor prime lignocelulozice. Enzimele imobilizate pot fi folosite ca amplificatoare de semnal slab. Centrul activ poate fi sub influența unui purtător care se află sub ultrasunete, stres mecanic sau supus transformărilor fitochimice.
