Absorbția și reemisia ulterioară a luminii de către mediile anorganice și organice este rezultatul fosforescenței sau fluorescenței. Diferența dintre fenomene este lungimea intervalului dintre absorbția luminii și emisia fluxului. Cu fluorescență, aceste procese apar aproape simultan, iar cu fosforescență, cu o oarecare întârziere.
Context istoric
În 1852, omul de știință britanic Stokes a descris pentru prima dată fluorescența. El a inventat noul termen ca urmare a experimentelor sale cu spatul fluor, care emite lumină roșie atunci când este expus la lumina ultravioletă. Stokes a remarcat un fenomen interesant. El a descoperit că lungimea de undă a luminii fluorescente este întotdeauna mai mare decât cea a luminii de excitație.
În secolul al XIX-lea au fost efectuate multe experimente pentru a confirma ipoteza. Ei au arătat că o varietate de probe au fluorescență atunci când sunt expuse la lumină ultravioletă. Materialele includ, printre altele, cristale, rășini, minerale, clorofilă,materii prime medicinale, compuși anorganici, vitamine, uleiuri. Utilizarea directă a coloranților pentru analiza biologică a început abia în 1930
Descrierea microscopiei cu fluorescență
Unele dintre materialele folosite în cercetare în prima jumătate a secolului al XX-lea erau foarte specifice. Datorită unor indicatori care nu au putut fi atinși prin metode de contrast, metoda microscopiei cu fluorescență a devenit un instrument important atât în cercetarea biomedicală, cât și în cea biologică. Rezultatele obținute au fost de o importanță nu mică pentru știința materialelor.
Care sunt beneficiile microscopiei cu fluorescență? Cu ajutorul noilor materiale, a devenit posibilă izolarea celulelor foarte specifice și a componentelor submicroscopice. Un microscop fluorescent vă permite să detectați molecule individuale. O varietate de coloranți vă permit să identificați mai multe elemente în același timp. Deși rezoluția spațială a echipamentului este limitată de limita de difracție, care, la rândul său, depinde de proprietățile specifice ale probei, detectarea moleculelor sub acest nivel este, de asemenea, destul de posibilă. Diverse probe prezintă autofluorescență după iradiere. Acest fenomen este utilizat pe scară largă în petrolologie, botanică, industria semiconductoarelor.
Funcții
Studiul țesuturilor animale sau al microorganismelor patogene este adesea complicat de autofluorescență nespecifică prea slabă sau foarte puternică. Cu toate acestea, valoarea încercetarea dobândește introducerea în material a unor componente excitate la o anumită lungime de undă și emitând un flux luminos de intensitatea necesară. Fluorocromii acționează ca coloranți capabili de auto-atașare de structuri (invizibile sau vizibile). În același timp, se disting prin selectivitate ridicată în ceea ce privește ținte și randamentul cuantic.
Microscopia cu fluorescență a devenit utilizată pe scară largă odată cu apariția coloranților naturali și sintetici. Aveau profiluri specifice de emisie și intensitate de excitație și vizau ținte biologice specifice.
Identificarea moleculelor individuale
Adesea, în condiții ideale, puteți înregistra strălucirea unui singur element. Pentru a face acest lucru, printre altele, este necesar să se asigure un zgomot suficient de scăzut al detectorului și un fundal optic. O moleculă de fluoresceină poate emite până la 300.000 de fotoni înainte de distrugere din cauza fotoalbirii. Cu o rată de colectare de 20% și eficiență a procesului, acestea pot fi înregistrate în valoare de aproximativ 60 mii
Microscopia cu fluorescență, bazată pe fotodiode de avalanșă sau pe multiplicarea electronilor, a permis cercetătorilor să observe comportamentul moleculelor individuale timp de câteva secunde și, în unele cazuri, de minute.
Dificultăți
Problema cheie este suprimarea zgomotului de pe fundalul optic. Datorită faptului că multe dintre materialele folosite la construcția filtrelor și lentilelor prezintă o oarecare autofluorescență, eforturile oamenilor de știință în stadiile inițiale s-au concentrat asupra emiteriicomponente cu fluorescență scăzută. Cu toate acestea, experimentele ulterioare au condus la noi concluzii. În special, s-a constatat că microscopia cu fluorescență bazată pe reflexia internă totală obține un fundal scăzut și o putere luminoasă de excitație ridicată.
Mecanism
Principiile microscopiei cu fluorescență bazate pe reflexia internă totală sunt de a utiliza o undă care se descompune rapid sau care nu se propagă. Apare la interfața dintre medii cu indici diferiți de refracție. În acest caz, fasciculul de lumină trece printr-o prismă. Are un indice de refracție ridicat.
Prisma este adiacentă unei soluții apoase sau cu o sticlă cu parametri mici. Dacă fasciculul de lumină este îndreptat spre el la un unghi care este mai mare decât cel critic, fasciculul este reflectat complet de interfață. Acest fenomen, la rândul său, dă naștere unei undă nepropagabilă. Cu alte cuvinte, se generează un câmp electromagnetic care pătrunde într-un mediu cu indice de refracție mai mic la o distanță mai mică de 200 de nanometri.
Într-o undă care nu se propagă, intensitatea luminii va fi destul de suficientă pentru a excita fluoroforii. Cu toate acestea, datorită adâncimii sale excepțional de mică, volumul său va fi foarte mic. Rezultatul este un fundal de nivel scăzut.
Modificare
Microscopia cu fluorescență bazată pe reflexia internă totală poate fi realizată cu epi-iluminare. Acest lucru necesită lentile cu deschidere numerică crescută (cel puțin 1,4, dar este de dorit ca acesta să atingă 1,45-1,6), precum și un câmp parțial iluminat al aparatului. Acesta din urmă se realizează cu un punct mic. Pentru o uniformitate mai mare, se folosește un inel subțire, prin care o parte a fluxului este blocată. Pentru a obține un unghi critic după care are loc reflexia totală, este necesar un nivel ridicat de refracție a mediului de imersie în lentile și în sticla de acoperire a microscopului.
