Cultivarea bacteriilor: metode, principii, pași și condiții

2024 Autor: Angel Austin | [email protected]. Modificat ultima dată: 2023-12-17 05:39

Microorganismele din natura din jurul nostru sunt peste tot: în sol, corpuri de apă, pe suprafețele diferitelor obiecte, oamenii și animalele sunt locuite de ele. Toate acestea pot servi ca surse de contaminare microbiană a alimentelor, medicamentelor și liniilor de producție. Cultivarea bacteriilor este necesară pentru a le studia proprietățile, nevoile și caracteristicile. Acesta, la rândul său, este un pas important în dezvoltarea diferitelor medicamente, diagnosticarea de laborator a bolilor, calculul reactoarelor de producție și multe altele.

Concepte generale

Cultivarea bacteriilor în microbiologie se referă la cultivarea microorganismelor efectuată în laborator. La rândul lor, microbii care au crescut pe un mediu nutritiv selectat se numesc cultură. Culturile pot fi amestecate dacă sunt formate din diferite tipuri de microorganisme și pure dacă sunt reprezentate de un singur tip de bacterii.

Dacă este nutriționalO singură celulă este plasată în mediu și se obține un grup de indivizi ca urmare a reproducerii sale, apoi acest set de microorganisme se numește clonă. Când o clonă se dezvoltă până la punctul în care devine vizibilă cu ochiul liber, această colecție de bacterii se numește colonie.

De obicei, cultivarea bacteriilor izolate din diferite surse se realizează separat una de ceal altă. Fiecare astfel de grup de microbi cultivat separat se numește tulpină. Deci, dacă un tip de stafilococ este izolat din trei surse (sau porțiuni diferite ale aceluiași produs, persoane diferite), se vorbește despre trei tulpini ale acestui tip de stafilococ.

Factori de creștere a bacteriilor

Aceste includ diverși aminoacizi, lipide, baze purinice și alți compuși necesari pentru dezvoltarea microorganismelor. Unii microbi pot produce în mod independent substanțele de care au nevoie, în timp ce alții trebuie să le primească în formă finită. În funcție de nevoile microorganismelor în anumiți factori de creștere, se realizează identificarea și diferențierea bacteriilor. De asemenea, acest parametru este important pentru prepararea corectă a unui mediu nutritiv pentru lucrări de laborator și biotehnologie:

• Aminoacizi. Bacteriile pot necesita un anumit aminoacid sau un grup de acizi. Deci, clostridiile au nevoie de leucină și tirozină, streptococii au nevoie de leucină și arginină. Microorganismele care necesită aminoacizi din exterior pentru a crește sunt numite auxotrofe.
• Baze purinice și pirimidinice, precum și derivații acestora (adenină, guanină și altele). Sunt un factor important în creșterea multoraSpecii de streptococ.
• Vitamine. Ele fac parte din coenzimele necesare bacteriilor. Deci, acidul nicotinic, precum și amida sa, care fac parte din NAD și NADP, sunt necesare pentru difteria și Shigella corynebacteriile. Tiamina, ca parte integrantă a pirofosfatului, este necesară de Staphylococcus aureus, pneumococ, brucella. Acidul pantotenic, care face parte din coenzima CoA, este necesar de bacilii tetanici și de anumite tipuri de streptococ. Citocromii și, prin urmare, acidul folic, hemele și biotina care le formează, sunt necesare pentru Mycobacterium tuberculosis și Haemophilus influenzae.

Cerințe de mediu

Condiții pentru mediile de cultură pentru cultivarea bacteriilor:

1. Nutriție. Ele trebuie sa contina substante, de altfel, intr-o forma usor digerabila, necesare microorganismelor pentru hranirea si refacerea energiei. Acestea includ organogeni și minerale. Unele microorganisme necesită în plus vitamine și aminoacizi pe care nu le pot sintetiza.
2. Nivel optim de pH. Afectează permeabilitatea membranei celulare și, în consecință, capacitatea de a absorbi substanțele nutritive de către bacterie. Cel mai adesea, valoarea pH-ului ar trebui să fie la nivelul de 7, 2–7, 4. Multe microorganisme în cursul vieții produc produse cu reacții acide sau alcaline și pentru ca pH-ul mediului nutritiv să nu se modifice, trebuie să fie stocat în tampon.
3. Izotonic. Presiunea osmotică din mediul nutritiv pentru cultivarea bacteriilor ar trebui să aibă aceleași valori ca șiîn interiorul celulelor microbiene. De obicei corespunde unei soluții de NaCl 0,5%.
4. Sterilitate. Acest lucru se datorează faptului că apariția bacteriilor străine va distorsiona rezultatele studiului tulpinii analizate.
5. Nivel de umiditate. Acest indicator, împreună cu consistența mediului, ar trebui să aibă caracteristici optime pentru un anumit tip de bacterii.
6. Potențial redox (RH2). Arată raportul dintre substanțele care donează și acceptă electroni, precum și nivelul de saturație în oxigen al mediului nutritiv. Pentru aerobi și anaerobi, condițiile de cultivare a bacteriilor diferă oarecum în acest indicator. Microorganismele anaerobe se reproduc cel mai bine la valori RH2 sub 5 și microorganismele aerobe cel puțin 10.
7. Uniformitate. Este important ca mediul de cultură să conțină cantități constante din ingredientele sale individuale. În plus, sunt de preferat soluțiile clare, care facilitează monitorizarea creșterii culturilor sau observarea contaminării.

Tipuri de medii de cultură

Alegerea unui anumit mediu pentru creșterea microorganismelor este influențată de mulți factori, printre care se numără caracteristicile nutriției acestora și scopul studiului. Principalele caracteristici care stau la baza clasificării mediilor nutritive sunt:

1. Componente. În funcție de substanțele inițiale utilizate pentru crearea substratului, acestea disting:

• naturale, care sunt preparate din produse de origine animală sau vegetală (de exemplu, carne, lapte, fructe) și sunt potrivite pentru cultivarea în amestecculturi;
• semisintetice, în care produsele alimentare naturale scumpe sunt înlocuite cu produse nealimentare (de exemplu, făină de oase, cheaguri de sânge) și care sunt optime pentru cultivarea anumitor tipuri de bacterii sau pentru izolarea produselor metabolice ale acestora din mediu;
• sintetice, care sunt preparate din cantități precise de compuși chimici, au o compoziție constantă cunoscută și sunt ușor de reprodus.

2. Consistență (densitate). Distinge mediile:

• lichid;
• dens;
• semilichid.

Ultimele două sunt preparate din soluții speciale sau substanțe lichide cu adaos de agar-agar sau gelatină pentru a crea densitatea necesară. În plus, un mediu dens pentru creșterea bacteriilor este serul de sânge coagulat, cartofii, mediul de gel de silice, caragenanul.

3. Compus. Pe această bază, mediile sunt:

• simple, a cărui listă este scurtă este Meat Peptone Broth (MBB), Hottinger Broth and Agar, Meat Peptone Agar (MPA), gelatină nutritivă și apă peptonă.
• complex, preparat din cele simple cu adaos de sânge, zer, carbohidrați și alte substanțe.

4. Programare. Se disting următoarele medii nutritive:

• main sunt folosite pentru a crește mulți microbi patogeni (de obicei compoziție simplă);
• cele speciale sunt folosite pentru a izola și cultiva bacterii care nu cresc pe substraturi simple;
• selective (sunt și selective) sunt potrivite pentru izolarea unui anumit tip de bacterii și inhiba creșterea microbilor asociați (selectivitatecreat prin adăugarea anumitor substanțe în mediu, cum ar fi antibiotice sau săruri, sau prin ajustarea pH-ului);
• diagnosticul diferențial face posibilă distingerea unui tip de bacterii de altul prin evaluarea activității enzimatice, de exemplu, a mediului;
• conservanți sunt necesari pentru inocularea inițială cu transportul ulterior al probelor, deoarece previn moartea microorganismelor, precum și inhibă creșterea altor bacterii.

Pregătire media

Cel mai important pas în cultivarea bacteriilor anaerobe este pregătirea unui mediu nutritiv adecvat. După ce sunt selectați parametrii optimi, treceți la următoarele etape:

• cântărire, prin selectarea unui eșantion de componente pe o balanță analitică;
• dizolvare efectuată în apă distilată încălzită la 70 °C, iar fosfații, micro și macrosărurile sunt dizolvate separat;
• fierbe într-o baie de apă timp de două minute;

Determinarea pH-ului

• cu ajutorul hârtiei indicator sau potențiometru;
• filtrare prin pânză umedă sau filtre de hârtie pentru lichide, precum și medii dense topite și printr-un filtru din tifon de bumbac pentru medii de agar;
• imbuteliere efectuată la 3/4 capacitate;
• sterilizare dependentă de mediu;
• controlul sterilității se efectuează prin instalarea timp de două zile într-un termostat, urmată de vizualizare;
• control chimic pentru a stabili pH-ul și conținutul necesaruluiarticole;
• control biologic prin inoculare de probă.

Sterilizarea articolelor din sticlă și a suporturilor

Unul dintre principiile de bază ale culturii bacteriene este sterilitatea. Creșterea și dezvoltarea microorganismelor străine pot afecta caracteristicile mediului nutritiv prin modificarea compoziției chimice și a pH-ului acestuia. Sterilizarea este condiția principală pentru creșterea culturilor pure. În practică, acest termen înseamnă metodele de distrugere a absolut toate formele de viață de la suprafață și în volumul obiectelor sterilizate. Vasele, instrumentele utilizate, mediile și alte articole utilizate în timpul studiului sunt sterilizate.

Unele tipuri de sterilizare:

• Aprindere. Sterilizarea buclelor și acelor pentru însămânțare, lame de sticlă, unele instrumente pot fi efectuate folosind un arzător sau lampă cu spirt.
• Fierbere. Potrivit pentru manipularea seringilor, acelor, alimentelor, dar nu ucide sporii bacterieni.
• Sterilizare la căldură uscată. Se desfășoară într-un dulap special de uscare și este potrivit pentru prelucrarea baloanelor, eprubetelor și a altor articole din sticlă de laborator.
• Sterilizare cu abur. Efectuată în autoclavă, această metodă este foarte eficientă. Dar nu este potrivit pentru mediile nutritive care conțin proteine sau orice alți compuși care se descompun la temperaturi ridicate. Mai multă economisire poate fi numită tindalizare. Se realizează în Boilerul Koch și combină germinarea sporilor cu distrugerea acestora.
• Pasteurizare. Este folosit pentru mediile care își schimbă proprietățile atunci când sunt fierte (de exemplu, lapte, vin, bere), capabile descăpați-le de microorganismele care nu poartă spori. Temperatura de procesare este de numai 50-60 ° C timp de cincisprezece până la treizeci de minute. În unele cazuri, se folosește sterilizarea la rece, efectuată folosind filtre sau raze UV.

Condiții de cultivare a bacteriilor

Creșterea și dezvoltarea bacteriilor este posibilă numai în funcție de anumiți factori și de valorile fiecăruia dintre ei:

1. Temperatura. Există trei grupuri de bacterii care diferă în ceea ce privește preferințele de temperatură:

• termofilii sau microbii iubitori de căldură cresc la 45-90°C, ceea ce înseamnă că nu se înmulțesc în organismele umane și animale;
• psihrofilele, sau microorganismele iubitoare de frig, preferă temperaturi în intervalul 5-15 °C și sunt cultivate în depozite frigorifice;
• mezofili, se dezvoltă la o temperatură de 25-37 °C, includ cea mai mare parte a bacteriilor.

2. Ușoară. Este o caracteristică a cultivării bacteriilor fototrofe, deoarece acestea realizează procesul fotosintetic. Dar pentru majoritatea microbilor, iluminarea nu este o condiție prealabilă. Și chiar și invers, ultravioletele solare le pot suprima dezvoltarea.

3. Apă. Toate microorganismele au nevoie de apă într-o formă accesibilă (lichid). Acesta este motivul pentru care alimentele congelate au o creștere mică sau deloc de bacterii.

4. Aciditatea mediului. Acest principiu al cultivării bacteriilor a fost deja discutat în detaliu mai sus.

5. Aerare. Oxigenul, ca element chimic, este o parte integrantă a apei și un număr considerabil de compuși utilizați pentrucultivarea microorganismelor. Oxigenul gazos poate fi, de asemenea, conținut în apă și alte lichide sub formă dizolvată. O parte semnificativă a bacteriilor are nevoie de un aport constant de molecule de oxigen. Dar pentru o serie de microorganisme, este inutil sau, mai rău, oxigenul gazos este toxic pentru ele, deoarece nu au catalază și peroxidază, care distrug produsele respiratorii toxice. Prin urmare, cel mai important pas în cultivarea bacteriilor anaerobe este îndepărtarea moleculelor O₂ din mediul nutritiv.

6. Cultivarea microorganismelor. Cultivarea bacteriilor aerobe și anaerobe se realizează în diferite straturi ale mediului și în moduri diferite.

Cultivarea microorganismelor aerobe

Cultivarea bacteriilor aerobe necesită oxigen molecular. Pentru a obține culturi pure de aerobi care pot fi utilizate cu succes în medicină și industria alimentară, se folosesc următoarele metode:

• suprafață care crește pe medii dense sau în medii lichide (stratul lor subțire) când oxigenul vine direct din aer;
• cultivare profundă în medii lichide, când o creștere a cantității de oxigen dizolvat în acestea se realizează prin aerare constantă.

Cultivarea microorganismelor anaerobe

Principiul de bază al cultivării bacteriilor de acest tip este contactul minim al acestora cu oxigenul atmosferic. Asigurarea condițiilor pentru creșterea lor este mult mai dificilă decât pentru aerobi. Următoarele metode sunt utilizate pentru a izola anaerobii din O moleculară₂:

1. Fizic. Această metodă de cultivare a bacteriilor anaerobe se reduce la cultivarea lor într-un aparat special de vid - un microanaerostat. Aerul din el este înlocuit cu un amestec gazos special de azot cu adaos de 10% hidrogen și 5% dioxid de carbon.
2. Chimic. Acestea includ: utilizarea agenților absorbanți (de exemplu, Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) sau agenți reducători (cum ar fi acidul ascorbic).
3. Biologic. Se reduce la co-cultivarea aerobilor și anaerobilor într-un sistem închis. Această metodă de cultivare a bacteriilor implică însămânțarea unei jumătăți dintr-un vas Petri cu unele dintre speciile aerobe de bacterii, iar ceal altă jumătate cu anaerobul studiat. Dezvoltarea sa va începe în momentul în care tot oxigenul este epuizat.

Următoarele metode de însămânțare sunt potrivite pentru cultivarea bacteriilor anaerobe:

• în stratul de suprafață;
• în stratul de suprafață umplut cu parafină sterilă;
• în grosimea unui mediu nutritiv dens;
• în straturi adânci de mediu vâscos.

Obținerea culturii pure

Microbiologii lucrează de obicei cu mostre locuite de multe tipuri diferite de microbi. Cu toate acestea, pentru a determina poziția sistematică a microorganismelor (familie, gen, specie), precum și pentru a studia caracteristicile acestora, este necesar să le izolăm și să crească o cultură pură. Sunt de mare importanță în multe industrii alimentare, de exemplu, brânza, pâine, kvas, vin etc. Cultivarea bacteriilor lactice face posibilă obținereao componentă esențială pentru producția de produse lactate fermentate, aluat, cacao, siloz și chiar plastic.

Metoda de izolare a unei culturi pure într-un mediu dens se bazează pe separarea mecanică a celulelor de microorganisme cu cultivarea lor izolată ulterioară. Proba se transferă într-un volum steril de apă sau soluție salină (volum 10-100 ml) și apoi se agită timp de două minute. Pentru extragerea microorganismelor situate în grosimea materialului studiat (de exemplu, cârnați sau brânză), se efectuează mai întâi frecarea pieselor de probă cu instrumente sterile cu nisip. Materialul care a suferit o pregătire preliminară, cântărind 1 g sau un volum de 1 ml, se diluează cu apă sterilă de 10, 100, 1000, etc. ori. Se alege gradul de diluție care oferă o concentrație de celule corespunzătoare capacităților metodei.

Cultivarea ulterioară a microorganismelor este pregătirea unui mediu nutritiv. De obicei se alege un mediu dens (MPA). Mai întâi se topește și se răcește la 45-50 °C și abia apoi se toarnă în mai multe vase Petri (trei până la cinci bucăți), pe fundul cărora se pun tampoane din substanța de testat de diferite concentrații. În continuare, se realizează amestecarea mediului nutritiv încă neînghețat și a materialului introdus în acesta. Acesta este modul în care celulele sunt fixate în diferite puncte ale volumului substratului.

În continuare, vasele Petri sunt plasate într-un termostat timp de 2 zile la 22 °C. În acest timp, celulele se înmulțesc în așa măsură încât colonia formată de fiecare dintre celule devine vizibilă cu ochiul liber. Fiecare dintre ele este o cultură pură a tipului de bacterii din ale căror celule estetrandafir.

După aceea, din cutiile Petri, microorganismele sunt subcultivate în eprubete separate umplute cu un mediu nutritiv. În acest fel, culturile pure sunt izolate dintr-o probă mixtă. Această metodă poartă numele dezvoltatorului său - R. Koch. De asemenea, este denumită în mod obișnuit metoda cupei sau semănatul epuizator. După obținerea unor culturi pure de diferite tipuri de bacterii, se determină forma, sporii și familiile acestora.

Toate lucrările trebuie efectuate conform principiilor asepsiei. Pentru a evita dezvoltarea prematură a microorganismelor, studiul trebuie efectuat imediat după prelevare. Apa de la robinet este analizată după scurgerea primelor porțiuni, deoarece acestea pot conține microbi acumulați în țevi și robinete. Microflora fructelor, fructelor de pădure și legumelor este localizată în principal la suprafață (coaja), prin urmare, se efectuează spălări din aceasta. Pentru a face acest lucru, puneți fătul într-un recipient steril și umpleți-l cu cantitatea necesară de apă. Apoi se agită destul de energic și se toarnă apa într-un alt recipient. Culturile din produse din pânză se obțin și în tampoane, dar în prealabil se decupează bucăți de o anumită dimensiune.